冠狀病毒的幾(jǐ)個(gè)離心分離方案

方案一  連續蔗糖梯度：離心機，轉頭。
單管配置：
1）13PET管：20%-50%（W/W）連續蔗糖梯度。
用0.01M Tris-Hcl配置蔗糖梯度
：用20%，25%，30%，35%，40%，45%，50%（W/W）蔗糖液各1.5ml，從離心管低部逐層向上鋪設（底部高密度），鋪二管，直立在試管架上室溫過夜
，第二天早晨放入冰箱僅5℃預冷2小時。在蔗糖液上部加樣品（約2ml）至距管口3mm。對稱放入P40ST轉頭吊桶（轉頭及吊桶在冰櫃中預冷過夜）對稱雙管，38,000rpm（256,000Xg）X 1小時，5℃ 加速8，減速7。
2）13PA管：20%-50%（W/W）連續蔗糖梯度
用0.01M Tris-Hcl配置蔗糖梯度：用20%，25%，30%，35%，40%，45%，50%（W/W）蔗糖液各1.2ml，從離心管低部逐層向上鋪設（低部高密度），鋪二管，直立在試管架上室溫過夜，第二天早晨放入冰箱5℃預冷2小時。在蔗糖液上部加樣品（約2ml）至距管口3mm。對稱放入P40ST轉頭吊桶（轉頭及吊桶在冰櫃中預冷過夜）對稱雙管，38,000rpm（256,000Xg）X 1小時，5℃ 加速8，減速7。
結果：冠狀病毒應沉降在蔗糖36%-40%之間（注意：空吊桶必須都按編号挂在轉頭上）

方案二 蔗糖階梯梯度
單管配置：用0.01M Tris-Hcl配置蔗糖梯度，離心管下部爲45%（W/W）（PET管爲4ml，PA管爲3ml），上部爲32%（W/W）（PET管爲4ml，PA管爲3ml），表面加樣品至距管口3mm（約爲4.5ml）。對稱雙管，38,000rpm（256,000Xg）X 1小時，5℃ 加速8，減速7。
結果：病毒沉降在二個蔗糖梯度之間。

方案三  Percoll自形成梯度：轉子（6X40ml）
單管配置：Percoll原液6.5ml，0.25M蔗糖23ml加樣品6ml，充分混合後注入40PA離心管至距管口3mm冰箱中預冷2小時後制備二管放入吊桶挂在轉頭上（其餘4個空吊桶也要挂上），20,000rpm，1小時，5℃ 加速8，減速8。
結果：病毒沉降在Percoll 1.06密度處。
梯度取出：1）手工取出：離心管傾斜小角度後用定量吸管吸出，13ml離心管分别收集26管（每管0.5ml），PA管分别收集21管（每管0.5ml），各管分别測OD給出OD→離心管管容量曲線,可以看到病毒峰,確定離心管編号後即可移出,蔗糖可通過透析除去.2）儀器收集:用日立 DGF-U梯度形成一收集儀,每次做一個管子,DGF-U後出口接流動池的分光光度計，連續測OD並繪出曲線後分部收集,根據病毒峰的位置,可以確定病毒集中在哪些離心管中,透析後得到較純病毒液.

方案四 用凍融法制備的Nycodenz分離冠狀病毒
單管配置 25% Nycondenz（密度1.127g/ml）8ml注入離心管，在-20℃冰箱中凍結，全部凍結後室溫中溶化即成爲（從液面到管底）密度從1.08g/ml到1.30g/ml的連續梯度，從1.08-1.16g/ml爲凸指數曲線，從1.16-1.30g/ml爲凹指數曲線。
     在已溶化的連續梯度上加入樣品至距管口3mm（PA管約爲2.5ml，PET管約爲4ml）
日立P40ST轉頭
，6x13mlTi吊桶，40,000rpm（284,000xg）12小時，加速8，減速7，20℃
離心後用DGF-U自動收集或人工收集成30管（每管0.3ml左右）在Nycodenz密度1.18g/ml處有病毒峰（離心管中段）。将30管分别測OD並繪制OD→管數曲線可找到病毒所在管
。
對稱管可用30%（W/W）蔗糖配置（密度在20℃時
，1.127g/ml）

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