用葡聚糖（Dextran）和聚乙二醇（Polyethyleneglycol,PEG）二相不連續梯度分離純(chún)化動植物樣品的細胞膜片斷（特别是質膜）的方法始於(yú)1989年（文獻1）。這種方法的特點是快速，操作簡單，重複性好。隻需要低速離心機（4,000rpm），分離成本低。
用PEG和Dextran 混合後再加入樣品，低速離心後形成上下二個液體相，體積相近 。上液體相中對於(yú)動(dòng)物細胞的亞細胞構造的排列，順序是（自下而上），内質網<線粒體<溶酶體<高爾基體<質膜；對於(yú)植物細胞其排列順序（自下而上）是 ：破碎的類囊體<完整的葉綠體<糙面内質網<線粒體，過氧化酶體<液泡膜<滑面内質網<類囊體<高爾基體<溶酶體<質膜。
常用的方法是：組織勻漿先以低速離心（甩平轉頭，500g，3min）去除沒有破碎的整細胞及其他組織碎片。上清液與Dextran 及PEG 混合後(hòu)再低速離心（3,000xg，15min）形成二個(gè)液體相。
離心方案 ：
1. 原液制備：
Dextran （20％w/w）：220克 Dextran T-500 （Pharmacia 産品） 溶於(yú)780克純水，電磁攪拌器加熱（40℃）並(bìng)攪拌至全部溶解。
PEG（3350，Union Carbide 公司出品 ，或相應産(chǎn)品）300克溶於(yú)1升水。
2. 制備(bèi)液體二相：取200克，20％ Dextran ，103克PEG原液，33ml 0.2M Na3PO4 （PH6.5）和179ml 純(chún)水在量筒中充分混合 ，靜置過夜形成二相液體，PEG在上，Dextran 在下 。可以看到明顯的分界面 ，中間有較窄的隔離帶。分别取出二液态相備(bèi)用（Dextran下相包含隔離帶）
3. 用合适的方法将含有107--108 個細胞的動 、植物組織制備(bèi)成勻漿，用低速小型冷凍離心機水平轉頭（如Hitachi CF-RX 系列離心機，T5SS31 甩平轉頭或 CF-7D2 離心機T5SS 轉頭，zui大容量 4×250ml 單管容量從(cóng)5ml 到 250ml，用戶可按實際情況選用不同容量的離心管。也可以用其他品牌離心機和相應的轉頭）
4. 勻漿(jiāng)在500g （約1,600rpm）4℃離心3分鍾去除沒有裂解的細胞和組織（在沉澱(diàn)中）
5. *次離心後(hòu)的上清液在3,000xg （約4,100rpm）4℃ 離心15分鍾，保留沉澱(diàn)。
6. 将第二次離心後的沉澱加入尚未形成二相的Dextran--PEG 混合液（第2步前段），充分混合。2,000xg（約3,300rpm）, 4℃離心10分鍾。離心後仍保持4℃。等待形成明顯的二個液态相（有隔離帶(dài)），亞細胞構造分布於(yú)二個液态相之中。
7. 分别收集（6） 離心後形成的二個含有亞細胞構造的液态相備(bèi)用（上相和下相 ，下相包含隔離帶(dài)）
8. 根據容量選擇合适的離心管（常用50ml 帶(dài)蓋(gài)圓底管），*類離心管下部是（2）中形成的Dextean液态相和隔離帶(dài)；上部是（7）中用水稀釋（3—5倍）的上相 。上、下部體積比爲6:4。
9. 第二類離心管下部是（7）中離心後的下相（包含隔離帶(dài)），上部是（2）中制備(bèi)的PEG液态相，上、下部液體的比例爲4:6
10. 以上二類(lèi)離心管，分别用上下颠倒30—40次的方法充分混合後(hòu)分别離心（3,000xg，約4,100rpm，4℃，10分鍾）
11. *類離心管離心後上部液态相中主要含質膜片斷(duàn) ，下部爲其他亞細胞構(gòu)造
12. 第二類離心管離心後上部及隔離帶(dài)中主要含質膜片斷(duàn)，下部爲其他亞細胞構造
讨論：
1. 不同的組織，分離質膜的離心轉速和時間(jiān)及PH值各有差異，可以從(cóng)實驗中摸索 ，優化。
2. 離心後其他亞細胞構(gòu)造可以用文獻中介紹的其他方法進一步分離純(chún)化（例如用Percoll，Nycodenz，metrizamide作自形成梯度分離）
參考文獻：
1. Fisher. D. and Sutherland, I.A. “Separations using aqueous phase system”—Applicaion In cell biology and biotechnology . plenum press , New York .1989
2. W . Howard Evans “Isolation and characterization of membranes and cell organelles”, from “Centrifugation” Edited by David Rickwood，Oxford Univ. press 1992
3. Presson A. 等 Biochem . J . vol:273 P173 （1991）
注：本文主要内容摘自文獻(xiàn)（2）
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更新時間 ：2011-07-08
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